2024年4月4日｜HiFiの長所
ロングリードシーケンサーに対する誤解 パート1- HiFiシーケンス
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急速に進化するゲノミクスの世界では、そのペースの速さに圧倒されることがあり、遅れをとることへの恐れを抱く人も多いと思います。ゲノム研究は絶え間なく変化しているため、何が利用可能かを常に把握しておきたいのであれば、事実を知っておく必要があります。少し前まで、ロングリードシーケンスは新興技術でした。今日、PacBio HiFiロングリードは、世界中で数千のゲノム、エピゲノム、トランスクリプトームのシーケンスに日常的に使用されています。HiFiシーケンスは、学術研究から大規模な集団健康調査まで、大小さまざまなプロジェクトで使用されています。
技術革新の速度があまりに劇的であるため、ロングリードシーケンスの精度、用途、コスト、利便性について誤解されている場合が多いです。
この6部構成のシリーズでは、ロングリードシーケンスに関する一般的な誤解を払拭していきます。シリーズのパート1では、PacBio HiFiシーケンスにまつわる一般的な誤解に焦点を当てます。
「それがいつものやり方だ」という古い情報は忘れ、新しい刺激的な情報を受け入れてください。
誤解その1：
PacBioのロングリードのエラー率は高すぎる。
事実
この主張は過去のものである。
多くの科学者は2011年にPacBio RSが登場したことで初めてロングリードシーケンシングを知りました。このシステムは1～10 kbのリードを生成する能力が注目されましたが、約10％のエラー率という大きな欠点がありました。ロングリードナノポア技術の精度は今でも課題ですが、PacBioシーケンシングはケミストリーとシーケンシング手法において驚異的な飛躍を遂げました。2019年、PacBioは15-20kbのリードで99.9％（エラー率0.1％）の精度を達成するHiFiシーケンスを発表しました。
今日では、この精度がPacBioの強みとなっています。HiFiリードは、ショートリードシーケンスと同等のリード精度に加え、ゲノムの繰り返しに必要な長さを持つという利点があります。HiFiリードは、100万塩基あたり1エラー未満のヒトゲノムの作成や、個々のDNA分子の変異の同定に使用されています。precisionFDA Truth Challenge v2やABRF Next-Gen Sequencing studyなどの一連のベンチマークにより、HiFiシーケンスが多くの側面で最も正確な技術であることが示されています。
誤解その2：
HiFiシーケンシングは他のシーケンシング技術に比べて高価すぎる。
事実:
この発言は単純化されています。
登場直後のロングリードシーケンサーは機械もランニングコストも高額でした。2010年代には、ヒトゲノムのシーケンスに何千ドルもかかり、小規模な微生物ゲノムでさえ、ライブラリーの前処理コストから高価なものと考えられていました。しかし、絶え間ない技術革新によりそれは変わりました。
2022年に発売されたRevioシステムにより、30× HiFiロングリードヒトゲノムのシーケンスコストは995ドル*になりました。自動ピペットシェアリングなどのライブラリー調製ワークフローの改善や、新しい高スループットHiFi Prepキットの導入により、サンプル調製のコストはヒトゲノムで～56ドル、微生物ゲノムで～39ドルに下がりました。マルチプレックスシーケンスにより、シーケンスコストはさらに削減できます。
- 5Mリードの全長トランスクリプトーム解析: トランスクリプトームあたり ～125ドル（SMRT Cellあたり8サンプル）
- 微生物ゲノム解析: 1ゲノムあたり ～3ドル（SMRT Cellあたり384サンプル）
HiFiシーケンスは、大型のショートリードシーケンスプラットフォームよりもGbあたりのコストは高いかもしれませんが、一般的なミッドスループットプラットフォームのコストとは同程度です。さらに重要なことは、HiFiシーケンスで得られる情報は豊富で、他のシーケンス技術と比較して、得られる情報あたりのコストが低いことです。ショートリードシーケンス法の中には、SNVなどの塩基対比較のコストが手頃なものもありますが、その対象範囲は限られており、構造変異の検出、ゲノムのフェージング、カバレッジの均一性の問題を解決するためには、通常、追加の実験が必要となります。これらの追加実験には時間と人件費がかかり、コストはかさみます。
対照的に、HiFiシーケンシングでは、研究者は1回の実験で遺伝的変異の全体像を把握することができ、他のシーケンシング技術に比べてかなり低い総費用で結果を得ることができます。
*US list price is $995 for sequencing reagents for one Revio SMRT Cell, which has an expected yield of 90 Gb, equivalent to a 30× human genome.
誤解その3：
HiFiシーケンシングはスループットが低く、効率的にスケールアップできない。
事実：
これは誤りです。
スループット面でもロングリードシーケンスは劇的に変化しています。PacBioシステムの各世代は、大きなスケールアップを果たしてきました。RevioシステムはSequel IIeシステムと比較して15倍のスループットの向上をもたらしました。より完全でフェージングされたヒトゲノムを、大規模な商業ラボやサービスプロバイダーでも利用可能なスループットで提供します。Revioシステムを使用することで、研究者はプロジェクトをスケールアップすることができ、年間最大3,900のde novo植物/動物ゲノム（1Gb）アセンブリー、最大5,200のKinnex全長RNAサンプル、または最大1,300のKinnexシングルセル・トランスクリプトミクスサンプルのシーケンスが可能です。
誤解その4：
HiFiシーケンサーのサンプル前処理とデータ解析は手間と時間がかかり、既存のラボのインフラとうまく統合できない。
事実：
この発言は時代遅れです。
サンプルのせん断、HiFiライブラリー前処理、解析ツールによって、これまで以上に迅速かつ簡単になりました。SMRTbell Prep キット3.0を使用して8サンプルを調製するのにかかる時間は約6時間（QCを含む）、HiFiゲノムシーケンス用の96サンプルをせん断して調製するのにかかる時間は約13時間で自動化も可能です。
シーケンス後のPacBio解析ツールは、バリアントコーリングからフェージング済みのde novoゲノムアセンブリまで、ワークフローのあらゆるステップで利用可能です。PacBio WGS Variant Pipelineのようなツールは、アライメントからアノテーションまで、二次および三次解析に利用できます。さらに、PacBio Compatibleパートナーや、コミュニティがサポートするその他の解析ツールにより、HiFiシーケンサーを初めて使用する方でも簡単に始めることができます。
誤解その5：
ロングリードシーケンスはニッチな技術で、de novoゲノムアセンブリや複雑な構造変異の検出にしか価値がない。
事実：
これは誤りです。
2022年のMethod of the Yearに選ばれたロングリードシーケンスは、もはやニッチな技術ではありません。むしろ、生物学のより完全な全貌にアクセスし、1回の実験で事実上すべての種類の変異を検出するために、研究者が選択する手法に急速になりつつあります。Revio システムでの PacBio HiFi シーケンスは、すべてのランに汎用性とマルチオミクス探索をもたらします。このシステムでは、4つのSMRTセルを同時にシーケンシングでき、1つのセルを全ゲノムシーケンス（WGS）、1つをRNA、1つをシングルセルRNA、1つをアンプリコンに利用できます。さらに、すべてのWGSランでメチル化コールも行われます。これにより、一度により多くの‘オーム’（ゲノム、エピゲノム、トランスクリプトームなど）にアクセスできるだけでなく、研究者はヒト、植物、動物、微生物などの異なる種類のサンプルを同時に処理することもできます。
2023年だけで1,000件以上の査読付き論文が発表されたことから示されるように、HiFiシーケンスの強力な能力は認められ続けています。1,200台以上のPacBioシーケンサーが40カ国以上に設置されており、ロングリードシーケンスは明らかにニッチな技術ではなく、むしろ未来の手法であることが示されています。
明日のゲノム発見は今日から始まります
HiFiシーケンサーの誤解を払拭しましょう！発見の最前線をリードする優秀なな頭脳を持つあなたが、シーケンス技術がどのように機能するかを先取りすることは、時代の最先端を行くことを意味します。HiFiロングリードとRevioシステムのようなプラットフォームがあれば、画期的な新発見の可能性は事実上無限です。
6回シリーズのパート2では、ヒトゲノム研究におけるロングリードシーケンスに関する一般的な誤解を払拭します。誤解破りはまだまだ続きます！