2024年4月25日｜RNAシーケンス
３つの Kinnex 活用事例：ヒト疾患研究のための全長RNAシーケンス
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オルタナティブスプライシングは、同じ遺伝子のエクソンが異なる方法で結合し、異なる（しかし関連性のある）RNA転写産物のアイソフォームが生じるときに起こります。
“オルタナティブ/代替”であるにもかかわらず、このプロセスは珍しいものではありません。ヒトゲノムの遺伝子の95％までがオルタナティブスプライシングを受けています。その結果生じるRNAの多様性は、ヒト生物学において重要な役割を果たしています。
このため、全長アイソフォームシークエンシングは、オルタナティブスプライシングによって遺伝子機能がどのように阻害され、疾患につながるかを調べることができる強力なツールとなっています。PacBio のHiFiリードを用いたロングリードRNAシーケンスにより、研究者は完全なアイソフォームのシーケンスを行うことができます。
導入： Kinnex PacBioの新しいKinnexキットはこの能力を強化し、スループットの壁を破ることで、これまでよりもはるかに高いスループットでロングリードRNAシーケンスを可能にします。MAS-Seqと呼ばれる手法を用いて、Kinnex kitは小さなアンプリコンをより大きなフラグメントへと連結し、HiFiリードの長さを最大限に活用します。現在では、大型研究でも使用可能なスケールで全長のRNA転写物のシーケンスを得ることができます。
ここでは、Kinnexの主要なアプリケーションを3つの演目でご紹介します。ヒト疾患におけるトランスクリプトームの変化を可視化するために、全長RNAシーケンスを使用している3人の研究者の話をお聞きください。
第一幕：Kinnexで希少疾患の謎を解く
この例では、サウサンプトン大学（@unisouthampton）の研究員であるCarolina Jaramillo Oquendo博士（@Carolinaj215）が、サウサンプトン大学病院（University Hospital Southampton NHS Foundation Trust）と共同で行った希少疾患サンプルの解析を紹介します。
Oquendo 博士は、新しいFull Length Kinnex RNA kitを使用して、希少疾患の病因におけるスプライシングバリアントを探索しています。彼女の研究では、Kinnexのデータは、希少疾患の症例、特にショートリードシーケンスでは説明がつかなかった症例における転写の違いを明らかにするのに有用でした。
Oquendo博士は、「イントロンのリテンションイベントのように見えたのですが、ショートリードシーケンスではよくわかりませんでした」と述べます。対照的に、PacBio Kinnexのデータでは、問題のイントロンをカバーする複数の転写産物が示され、オルタナティブスプライシングイベントが確認されました。
Oquendo博士は、Kinnex RNAキットが、Nanopore技術と比較して、データ処理にどのような利点をもたらすかについても説明します：
「Kinnexのデータそのものは実にクリーンであり、データサイズも計算時間とリソースを節約できるのが大きな利点でした。以前、 Oxford Nanopore のデータを扱ったことがありますが、非常に大きく、1サンプルを処理するのに何週間もかかりました。PacBioのデータはとても小さく、しかも高品質でした」。
– サウサンプトン大学、Carolina Jaramillo Oquendo博士
第二幕：Kinnexデータを用いたアイソフォームの定量化
RNA転写物のアイソフォームを正確に定量することは、完全なトランスクリプトーム解析にとって不可欠であり、疾患の背後にある分子メカニズムに光を当てることができる。この例では、チューリッヒ大学のDavid Wissel氏（@UZH_en）が、Kinnex full length RNA kitを用いてアイソフォームを定量する方法を紹介しています。
Wissel氏が説明するように、PacBioロングリードRNA-Seqがアイソフォーム探索に極めて有効であることはよく知られています。しかし、定量や転写産物の比較発現のようなワークフローではどうなのでしょうか？
回答： Wissel氏によれば、「かなり良好」です。
彼は、KinnexのロングリードRNAデータとショートリードRNAデータを比較し、Kinnexの定量はショートリードデータと同等の再現性を示すことを発見しました。Wissel氏は、Kinnex RNA-Seqは1つのデータセットでアイソフォームの発見と定量が可能であり、これは大きな利点であると結論付けています。
「Kinnexを導入する前は、PacBioが最高のリード長と品質を持っていました。現在、Kinnexを使用することで、PacBioのRNA-SeqデータはイルミナのRNA-Seqデータに匹敵する収量も得ることができます。」
-チューリッヒ大学David Wissel氏
また、オープンソースツールをKinnexデータセットで簡単に実行できることを示し、コミュニティがサポートする解析ツールを使用してアイソフォームを定量化し、発現量の異なる遺伝子や転写産物を同定する方法を説明します。
また、Kinnex full length kitを用いたアイソフォームシーケンスについては、アプリケーションノートをご覧ください。
第3幕：心血管系疾患の空間トランスクリプトミクスにおける局所的アイソフォームスイッチングイベントの解明
アイソフォームによって挙動が異なるため、あるアイソフォームから別のアイソフォームへの発現の変化は、疾患生物学に影響を及ぼします。アイソフォームスイッチングとは、細胞があるRNAアイソフォームを発現している状態から、別のアイソフォームを発現し始めることを指します。同じ組織内でも、細胞によってアイソフォームの構成が異なることがあるため、このような遺伝子発現の変化を見るためには、シングルセルレベルの分解能が必要となります。
全長アイソフォーム解析が可能なロングリード空間トランスクリプトミクスは、心臓の発生、機能、疾患に対するわれわれの理解を大きく変えつつあります。この例では、ハイデルベルク大学病院のChristoph Dietrich博士のチームが、PacBioシングルセルRNAシーケンスを使って、心臓発作後の心臓組織におけるアイソフォームスイッチングを調べている。
MAS-Seq（Kinnexキットと共通の手法）を用いて、Dietrich博士と研究チームは心臓発作後の117の局所的アイソフォームスイッチングイベントを同定しました。問題の心臓組織の部位によって、個々の遺伝子についてアイソフォームの存在量と発現パターンはかなり変化します。研究チームは、PacBioシーケンスによって、新規のアイソフォームを含む多くの異なるタイプのアイソフォームや、局所的なアイソフォームスイッチングを検出できることを発見しました。
「非常に貴重な情報であり、非常に豊富な情報セットです」
-ハイデルベルク大学病院、Christoph Dietrich博士
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